Capillaire elektroforese (CE) is een analytische scheidingstechniek waarbij geladen deeltjes in een dunne, met buffer gevulde capillair worden gescheiden onder invloed van een sterk elektrisch veld. De techniek combineert de hoge scheidingsefficiëntie van elektroforese met de snelheid en automatisering van een instrumentele analyse. Capillaire elektroforese wordt toegepast voor de scheiding van ionen, eiwitten, DNA-fragmenten, geneesmiddelen en kleine organische moleculen, vaak met een resolutie die die van vloeistofchromatografie overtreft.
Bij capillaire elektroforese wordt een nauwe capillair (binnendiameter 25–100 µm, lengte 20–100 cm) gevuld met een geleidende buffer (achtergrondelektrolyt). De uiteinden van de capillair staan in twee bufferreservoirs, elk voorzien van een elektrode. Wanneer over de capillair een hoge spanning wordt aangelegd (10–30 kV), migreren geladen deeltjes door de capillair op basis van hun lading en grootte. Een detector bij het uiteinde van de capillair registreert de deeltjes naarmate ze passeren, wat resulteert in een elektroferogram: een grafiek van detectorsignaal tegen migratietijd.
De scheiding berust op twee gelijktijdige verschijnselen:
De waargenomen migratiesnelheid van een deeltje is de som van zijn eigen elektroforetische mobiliteit en de elektro-osmotische flow. Hierdoor kunnen in één analyse kationen, neutrale moleculen en anionen na elkaar worden gedetecteerd: kationen het eerst (eigen migratie plus EOF in dezelfde richting), dan neutrale deeltjes (alleen meegevoerd door de EOF), en tot slot anionen (eigen migratie tegen de EOF in, maar door de sterke EOF toch meegesleept).
Capillaire elektroforese is een verzamelnaam voor meerdere scheidingsmodi, die elk een ander scheidingsmechanisme benutten:
De meest gebruikte en eenvoudigste modus. De capillair is gevuld met één homogene buffer en de scheiding berust uitsluitend op verschillen in lading-massaverhouding. CZE is breed inzetbaar voor de scheiding van ionen, organische zuren, peptiden en eiwitten.
De capillair is gevuld met een polymeernetwerk (vervangbare gelmatrix) dat als moleculaire zeef werkt. Grote moleculen bewegen langzamer door het netwerk dan kleine. CGE is de techniek achter geautomatiseerde DNA-fragmentanalyse en DNA-sequencing — de scheiding van DNA-fragmenten op lengte vormt de basis van capillaire sequencers zoals gebruikt bij Sanger-sequencing.
Voor de scheiding van enantiomeren wordt aan de bufferoplossing een chirale selector toegevoegd, doorgaans een cyclodextrine (α-, β- of γ-cyclodextrine, eventueel gederivatiseerd). De enantiomeren vormen voorbijgaande inclusiecomplexen met de selector en migreren daardoor met verschillende snelheden. Chirale CE is een aantrekkelijk alternatief voor chirale HPLC: lagere kosten, snel ontwikkelbaar en met klein monstervolume. Toegepast bij farmaceutische verbindingen, aminozuren en agrochemicaliën.
Een monster wordt geïnjecteerd via een van twee methoden:
Door slim gebruik te maken van verschillen in geleidingsvermogen kan een verdund monster bij injectie sterk worden geconcentreerd. Bij field-amplified sample stacking (FASS) wordt het monster opgelost in een buffer met lagere ionensterkte dan de scheidingsbuffer. Bij aanleggen van de spanning is het elektrische veld in het monster lokaal hoger, waardoor ionen sneller migreren tot ze de hoofdbuffer bereiken en daar afremmen en concentreren. Deze techniek kan de gevoeligheid met een factor 10 tot 1000 verbeteren en compenseert deels het kleine injectievolume van CE.
De gescheiden deeltjes worden ter plaatse in de capillair gedetecteerd. De meest gebruikte detectiemethoden zijn:
Capillaire elektroforese en vloeistofchromatografie (HPLC) zijn complementaire scheidingstechnieken. De belangrijkste verschillen:
Voor reproduceerbare CE-resultaten zijn enkele praktische aspecten cruciaal:
Bij microchip-elektroforese wordt de capillair vervangen door microkanalen geëtst in glas, kwarts of polymeer. Doordat de scheidingsafstand korter is en de warmteafvoer beter, kunnen analyses in seconden worden voltooid in plaats van minuten. Microchip-CE vormt de basis van veel lab-on-a-chip-systemen, zoals de Bioanalyzer en TapeStation voor DNA- en eiwitanalyse, en wordt steeds vaker toegepast in point-of-care diagnostiek.
Capillaire elektroforese onderscheidt zich door een uitzonderlijk hoge scheidingsefficiëntie, een minimaal monster- en reagentiaverbruik en korte analysetijden. De techniek is breed toepasbaar, van kleine ionen tot grote biomoleculen. Tegenover deze voordelen staan enkele beperkingen: de gevoeligheid van UV-detectie is door de korte optische weglengte lager dan bij HPLC, de reproduceerbaarheid van de migratietijd is gevoelig voor veranderingen aan het capillairoppervlak en de Joule-verwarming, en de techniek vereist zorgvuldig onderhoud van de capillair en de buffers om consistente resultaten te behalen.
Capillaire elektroforese sluit aan bij andere scheidings- en analysetechnieken in de kennisbank. Zie de artikelen over vloeistofchromatografie, ionenwisselchromatografie en next-generation sequencing voor verwante methoden in de moleculaire analyse. Voor benodigde verbruiksartikelen kunt u terecht in de categorie chromatografie of neemt u contact op voor advies.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
