De MTT-assay is de meest gebruikte methode voor het bepalen van celviabiliteit en celproliferatie in het laboratorium. Het principe berust op de omzetting van het gele tetrazoliumzout MTT door metabolisch actieve cellen in een paars formazanproduct, waarvan de hoeveelheid spectrofotometrisch wordt gemeten. Hoe meer levende, metabolisch actieve cellen aanwezig zijn, hoe intenser de kleur. De assay wordt ingezet voor cytotoxiciteitstests, screeningsstudies van geneesmiddelen, en de beoordeling van behandelingseffecten op celgroei en -overleving.
Celviabiliteit (ook wel cellevensvatbaarheid of cellulaire levensvatbaarheid) is het percentage levende cellen in een celmonster ten opzichte van het totale aantal cellen. Een hoge celviabiliteit geeft aan dat cellen metabolisch actief en intact zijn; een lage celviabiliteit duidt op celdood, stress of beschadiging. In celkweekexperimenten is een celviabiliteit van 90% of hoger de standaard voor gezonde kweken die geschikt zijn voor experimenten. Een celviabiliteit onder 70% wijst op problemen met het kweekmilieu, een besmetting, of een giftig effect van een teststof.
Levensvatbare cellen hebben een intacte celmembraan, een functionerend metabolisme en het vermogen om te delen. Niet-levensvatbare cellen hebben de membraanintegriteit verloren — een van de vroegste en meest betrouwbare indicatoren van celdood. Dit onderscheid vormt de basis van veel viabiliteitstesten: kleurstoffen zoals trypan blauw dringen door beschadigde membranen, waardoor dode cellen blauw kleuren en levende cellen kleurloos blijven.
MTT staat voor 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide, een geel, wateroplosbaar tetrazoliumzout. Metabolisch actieve cellen reduceren MTT tot paars, onoplosbaar formazan. De reductie wordt uitgevoerd door NAD(P)H-afhankelijke oxidoreductasen, waarvan oorspronkelijk werd aangenomen dat ze uitsluitend mitochondriaal waren (succinaatdehydrogenase). Modern onderzoek heeft echter aangetoond dat zowel mitochondriale als cytoplasmatische en endosomale enzymen bijdragen aan de reductie. Het signaal is daarmee een maat voor de algehele metabole activiteit van de cel, niet uitsluitend voor mitochondriale functie. De assay is kwantitatief: de intensiteit van de paarse kleur, gemeten via absorptie bij 570 nm, is evenredig met het aantal levende, metabolisch actieve cellen.
Het biochemische principe verloopt in drie stappen:
Formazan absorbeert maximaal bij circa 570 nm (het absorptiemaximum ligt tussen 540 en 590 nm, afhankelijk van het oplosmiddel). Bij deze golflengte is het signaal het sterkst en de gevoeligheid het hoogst. De referentiegolflengte van 630–690 nm wordt gebruikt voor achtergrondcorrectie; bij die golflengten absorbeert formazan nauwelijks, zodat het verschil tussen 570 nm en de referentiegolflengte een betrouwbaarder signaal oplevert.
DMSO wordt gebruikt als solubilisatiemiddel omdat het formazankristallen snel en volledig oplost in een homogene, paarse oplossing die stabiel is voor spectrofotometrische meting. DMSO is ook effectief bij kamertemperatuur, waardoor het protocol eenvoudig en snel uitvoerbaar is. Nadeel: DMSO is hygroscopisch en damp kan de microplaatlezer beïnvloeden; de plaat moet direct na toevoeging van DMSO worden afgelezen. Bovendien lyseert DMSO de cellen, waardoor de meting een eindpunt is en er na de assay geen levende cellen meer beschikbaar zijn.
Voor een betrouwbare MTT-assay moet het inzaaigetal binnen het lineaire bereik van de assay vallen: de absorptie moet recht evenredig zijn met het aantal cellen. Het optimale inzaaigetal hangt af van het celtype, de behandelingsduur en de proliferatiesnelheid. Vuistregels:
Een celkalibratiecurve (absorptie versus inzaaigetal, gemeten op het tijdstip van MTT-toevoeging) is voor elke nieuwe cellijn essentieel om het lineaire bereik vast te stellen. Buiten dit bereik treedt verzadiging op (te veel cellen, signaal vlakt af) of is het signaal te dicht bij de detectiegrens (te weinig cellen).
De celviabiliteit wordt uitgedrukt als percentage ten opzichte van een onbehandelde controlereeks:
Celviabiliteit (%) = (absorptie behandeld − absorptie blanco) / (absorptie onbehandeld controle − absorptie blanco) × 100
Een waarde van 100% betekent geen effect op celviabiliteit; een waarde van 50% duidt op een halvering van het signaal. Voor een betrouwbare berekening is het essentieel dat de blanco-wells (medium zonder cellen, maar met MTT en DMSO) worden meegemeten en van alle absorptiewaarden worden afgetrokken.
Bij dosis-respons-curves worden verschillende drempelwaarden gebruikt die niet altijd hetzelfde betekenen:
Voor een correcte interpretatie wordt een dosis-respons-curve gefit met een sigmoïdaal model (vier-parameter Hill-vergelijking), waaruit IC50/GI50 en de Hill-coëfficiënt worden afgeleid.
Voor publicatie- en regelgevingskwaliteit gelden de volgende richtlijnen:
De MTT-assay is een kwantitatieve methode: de gemeten absorptie is binnen een lineair bereik proportioneel aan het aantal metabolisch actieve cellen. Het lineaire bereik hangt af van het celtype en de celdichtheid, maar ligt typisch tussen 1.000 en 50.000 cellen per well bij een 96-well formaat. Buiten dit bereik is de relatie niet meer lineair en zijn resultaten onbetrouwbaar.
Celviabiliteit en cytotoxiciteit zijn twee kanten van dezelfde munt, maar meten een ander aspect:
Cytotoxiciteit en viabiliteit zijn niet altijd elkaars perfecte spiegelbeeld: een afname van het MTT-signaal kan worden veroorzaakt door celdood (echte cytotoxiciteit), maar ook door een louter anti-proliferatief effect waarbij cellen levend blijven maar niet meer delen. Voor het onderscheid is een aanvullende methode nodig, zoals een LDH-vrijzettingsassay (specifiek voor membraanschade) of trypan blauw-exclusie.
Celproliferatie en apoptose zijn tegengestelde processen. Celproliferatie is de toename van het celaantal door celdeling; apoptose is geprogrammeerde, gecontroleerde celdood. De MTT-assay meet metabolische activiteit en kan beide niet direct onderscheiden: een afname van het MTT-signaal kan duiden op verminderde proliferatie, apoptose, of necrose. Voor het onderscheid tussen apoptose en necrose zijn aanvullende methoden nodig, zoals caspase-activiteitstests of annexine-V/propidiumjodide-flowcytometrie.
Naast de MTT-assay zijn er andere veelgebruikte celviabiliteitstests, elk met eigen voor- en nadelen:
Foetaal bovien serum (FBS) bevat groeifactoren, hormonen, adhesieproteïnen en transporteiwitten die essentieel zijn voor de proliferatie en het overleven van de meeste celtypes in kweek. Een concentratie van 10% FBS is de standaard voor veel cellijnen en biedt een optimale balans tussen groeiondersteuning en kostprijs. Te weinig FBS leidt tot verminderde celgroei en lagere viabiliteit; te veel FBS kan de resultaten van cytotoxiciteitstests verstoren doordat serumeiwitten teststoffen binden. Voor de MTT-assay is het standaard om alle behandelingen in medium met hetzelfde FBS-percentage uit te voeren als de kweekcondities.
De MTT-assay is onderdeel van een bredere celkweekpraktijk. Zie het kennisbankartikel over celkweektechnieken voor achtergrond bij het opzetten en onderhouden van celkweken. Bekijk ook het artikel over bioreactoren en fermentatie voor schaalvergroting van celkweekprocessen. Voor microplaatlezers, pipetten en verbruiksartikelen voor de MTT-assay kunt u terecht in de categorie biotechnologie & moleculaire biologie of petrischalen, PCR-platen & microtiterplaten.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
