UHPLC staat voor Ultra-High Performance Liquid Chromatography. Het is een doorontwikkeling van klassieke HPLC waarbij stationaire-fasedeeltjes met een diameter kleiner dan 2 µm worden gebruikt, in combinatie met pompen die druk tot ongeveer 1500 bar kunnen leveren. Door deze combinatie levert UHPLC dezelfde of betere scheidingsefficiëntie als HPLC in een fractie van de analysetijd, met smallere chromatografische pieken en lager oplosmiddelverbruik.
Waar HPLC sinds de jaren zeventig de standaard is voor vloeistofchromatografie, werd UHPLC in 2004 commercieel geïntroduceerd door Waters Corporation onder de handelsnaam UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography). UPLC is dus een merkgebonden term — andere fabrikanten brachten vergelijkbare systemen onder eigen handelsnamen op de markt, en de overkoepelende, leveranciersonafhankelijke aanduiding daarvoor werd UHPLC. In de praktijk worden beide termen vaak door elkaar gebruikt; technisch wijzen ze op hetzelfde principe.
Een UHPLC-systeem is functioneel identiek aan een HPLC-systeem en bestaat uit dezelfde vier hoofdonderdelen, maar elk onderdeel is uitgevoerd in een drukbestendigere en preciezere variant:
De mobiele fase stroomt continu vanuit twee of meer oplosmiddelreservoirs door de pomp, neemt het geïnjecteerde monster mee, en draagt de componenten door de kolom naar de detector. De tijd waarin een component niet wordt vastgehouden door de stationaire fase — de tijd voor het oplosmiddel zelf om door het systeem te stromen — heet de dode tijd (t₀). De totale tijd dat een component erover doet om geëlueerd te worden, heet de retentietijd (tR). Het verschil tussen beide bepaalt de retentiefactor en is een maat voor de interactie met de stationaire fase.
De prestaties van een chromatografische scheiding worden beschreven door de Van Deemter-vergelijking H = A + B/u + Cu, waarbij H de plaathoogte is en u de lineaire flowsnelheid. Hoe kleiner de plaathoogte, hoe efficiënter de scheiding. Bij conventionele HPLC met deeltjes van 3–5 µm ligt het optimum van deze curve relatief laag, en stijgt H bij hogere flowsnelheden snel. Bij sub-2-µm deeltjes zijn alle drie de termen kleiner:
De A-term (Eddy-diffusie) daalt omdat de stromingskanalen uniformer zijn. De B-term (longitudinale diffusie) is vergelijkbaar. De C-term (massaoverdrachtsweerstand) daalt sterk doordat de diffusieafstand binnen de kleinere deeltjes korter is. Het resultaat: een vlakkere Van Deemter-curve met een lager minimum, waardoor de scheiding niet alleen efficiënter is, maar ook bij veel hogere flowsnelheden zonder kwaliteitsverlies kan worden uitgevoerd. Dat is de kern van UHPLC.
Deze efficiëntiewinst heeft echter een prijs: de tegendruk neemt kwadratisch toe naarmate de deeltjes kleiner worden. Een conventioneel HPLC-systeem met een drukbereik tot 400 bar kan sub-2-µm deeltjes niet aansturen bij praktisch bruikbare flowsnelheden. Daarom werken UHPLC-systemen met pompen die tot 1300–1500 bar leveren, met aangepaste leidingen, fittingen en injectoren die deze drukken zonder lekkage of vervorming aankunnen.
De overstap van HPLC naar UHPLC is niet alleen een kwestie van een snellere methode kunnen draaien — het verandert hoe de hele scheiding wordt opgezet. De voornaamste verschillen op een rij:
De vraag "is UHPLC duurder dan HPLC?" hangt sterk af van wat in de berekening wordt meegenomen. De aanschafprijs van een UHPLC-systeem ligt hoger dan die van een conventioneel HPLC-systeem, en sub-2-µm kolommen kosten meer per stuk. Daar staat tegenover dat het verbruik aan acetonitril en andere oplosmiddelen aanzienlijk lager ligt en dat de monsterdoorvoer een veelvoud is. Voor laboratoria met hoge monsterdoorvoer is de totale kostprijs per monster bij UHPLC vaak lager dan bij HPLC.
De combinatie van snelheid, resolutie en gevoeligheid maakt UHPLC inzetbaar in vrijwel elk veld waar HPLC ook wordt gebruikt — met name daar waar doorloop of detectielimiet kritisch zijn:
Een van de belangrijkste drijfveren achter de opmars van UHPLC is de koppeling met massaspectrometrie. De smalle pieken van UHPLC passen bijzonder goed bij de hoge meetfrequentie van moderne massaspectrometers. Een veelgebruikte configuratie is UHPLC-Q-TOF MS: een UHPLC-systeem gekoppeld aan een quadrupool-time-of-flight massaspectrometer. De quadrupool fungeert als massafilter en de time-of-flight-analyser meet de uitgefilterde of gefragmenteerde ionen met hoge massanauwkeurigheid. Deze opstelling wordt veel gebruikt voor non-target screening, identificatie van onbekende verbindingen en exacte-massa-analyse.
Voor de gerichte kwantificering op spoorniveau is UHPLC-MS/MS met een triple-quadrupool massaspectrometer de standaard. Lees meer over deze koppelingstechnieken in het artikel over LC-MS en LC-MS/MS.
Een chirale (chiral) UHPLC-scheiding is een UHPLC-methode waarbij de stationaire fase een chirale selector bevat, zoals derivaten van polysacchariden (cellulose, amylose), cyclodextrines of macrocyclische antibiotica. Hiermee worden enantiomeren — moleculen die spiegelbeelden van elkaar zijn — van elkaar gescheiden. Dit is van bijzonder belang in de farmaceutische industrie, waar beide enantiomeren van eenzelfde werkzame stof drastisch verschillende biologische effecten kunnen hebben. UHPLC heeft de chirale scheiding versneld van vaak meer dan een half uur naar enkele minuten, met scherpe piekvormen die de scheiding ook bij lage enantiomeerverhoudingen mogelijk maken.
UHPLC stelt strengere eisen aan de zuiverheid van de mobiele fase dan HPLC. Door de hogere gevoeligheid en smalle pieken veroorzaakt elke verontreiniging zichtbare achtergrondsignalen of fantoompieken. Het water in de mobiele fase moet daarom van UHPLC-kwaliteit zijn (of beter): ultrazuiver, met een lage organische koolstofbelasting (TOC < 5 ppb) en lage ionenbelasting. Voor de organische component (acetonitril, methanol) geldt minimaal de specificatie "LC-MS grade" of "UHPLC grade" — zie ook het artikel over zuiverheidsgraden van chemicaliën. Onvoldoende zuivere oplosmiddelen veroorzaken bij UHPLC sneller drukvariaties, kolomverstopping en achtergrondruis.
De stationaire fase voor UHPLC bestaat doorgaans uit poreuze silicadeeltjes van 1,7–1,8 µm met C18- of C8-modificatie voor omgekeerde-fase scheiding. Naast volledig poreuze deeltjes worden ook core-shell-deeltjes (SPP, superficially porous particles) gebruikt: deze hebben een dichte kern met een dunne poreuze schil. Core-shell-deeltjes leveren UHPLC-achtige efficiëntie bij iets lagere tegendruk, en zijn daardoor ook bruikbaar in conventionele HPLC-apparatuur (tot 400 bar) en in UHPLC. Een andere alternatieve stationaire fase zijn monolietkolommen, die met hun open structuur zeer lage tegendrukken combineren met hoge flowsnelheden.
UHPLC-kolommen zijn typisch 50 tot 150 mm lang met een interne diameter van 2,1 mm. De combinatie van korte lengte en kleine deeltjes geeft de gewenste hoge plaatcapaciteit per minuut. Voor analyses met extreem hoge gevoeligheid worden ook smallere kolommen (1,0 mm i.d.) of capillaire en nano-LC ingezet.
Bij het werken met UHPLC zijn enkele aspecten kritisch voor consistente prestaties. Het extra-kolomvolume (dwell volume en de volumes van leidingen, injector en detectorcel) moet zo klein mogelijk zijn — anders gaat de winst in piekbreedte verloren door verbreding buiten de kolom. Gebruik altijd de fabrikantsfittingen en goed gesneden capillaire leidingen met de juiste binnendiameter. Filter elke mobiele fase door een 0,22 µm membraanfilter en ontgas voor gebruik om gasbellen te voorkomen die bij hoge druk vooral problematisch zijn.
Monstervoorbereiding is bij UHPLC belangrijker dan bij HPLC: deeltjes > 0,2 µm in het monster verstoppen de kolominlaat. Filter monsters altijd door een 0,2 µm spuitfilter, of pas solid-phase-extractie (SPE) toe voor matrixzuivering. Spoel de kolom na gebruik volgens fabrikantsprotocol en sla deze op in het aanbevolen bewaaroplosmiddel.
UHPLC vormt samen met conventionele HPLC, capillaire LC en nano-LC een continuüm aan vloeistofchromatografische technieken die zich onderscheiden in deeltjesgrootte, kolomdimensies en flowbereik. Voor een breder overzicht van het vakgebied, zie het artikel over vloeistofchromatografie. Wie de techniek vanaf de basis wil leren begrijpen, vindt de fundamenten terug in de klassieke kolomchromatografie — alle moderne vormen van LC bouwen voort op hetzelfde scheidingsprincipe.
Bekijk het assortiment chromatografiebenodigdheden of neem contact op voor advies over de juiste opstelling voor uw toepassing.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
