Het kwantificeren van celgroei is een van de meest fundamentele handelingen in microbiologie, celbiologie en biotechnologie. Of het gaat om de groei van bacteriën in een fermentatieproces, de expansie van gistcellen tijdens de productie van recombinante eiwitten of de proliferatie van zoogdiercellen in een bioreactor (lees ook ons artikel: celkweektechnieken in het laboratorium) — in elk geval is een betrouwbare, reproduceerbare methode voor celkwantificering onmisbaar. De meest gebruikte techniek is de meting van de optische dichtheid bij 600 nm, afgekort als OD600. Dit artikel beschrijft het werkingsprincipe, de praktische uitvoering, de beperkingen en de alternatieve methoden voor celgroei-meting.
Celgroei is het proces waarbij cellen in aantal toenemen door deling. In de microbiologie en celbiologie verwijst de term doorgaans naar de toename van de celpopulatie in een kweekmedium — niet naar de groei van individuele cellen in omvang. Elke cel deelt zich in twee dochtercellen, die zich op hun beurt opnieuw delen: bij voldoende voedingsstoffen en optimale omstandigheden leidt dit tot exponentiële toename van het celgetal.
Celgroei meten is om meerdere redenen essentieel in het laboratorium. In de microbiologie bepaalt de groeicurve het optimale tijdstip voor oogst, de effectiviteit van antibiotica of desinfectiemiddelen en de reproductie van experimentele condities. In de biotechnologie en fermentatie is celgroei een directe maat voor de productiviteit van het proces: meer cellen betekent doorgaans meer doelproduct, of het nu gaat om recombinante eiwitten, enzymen of gefermenteerde metabolieten. In de farmacologie en toxicologie vormt celgroei de basis voor proliferatietesten, waarbij de remmende werking van een stof op celdeling gekwantificeerd wordt. En in het onderwijs maakt het bestuderen van celgroei de principes van microbiologie en celbiologie concreet en meetbaar.
Waarom celgroei belangrijk is, laat zich samenvatten in één zin: zonder betrouwbare celkwantificering zijn experimenten niet reproduceerbaar, processen niet beheersbaar en resultaten niet vergelijkbaar. De keuze van de juiste meetmethode — en de juiste apparatuur en materialen daarvoor — is daarom een kritische beslissing in elk laboratoriumprotocol.
Snel antwoord: OD600 vuistregels
Lineair bereik: OD600 0,1–0,8 — verdun bij hogere waarden en vermenigvuldig met de verdunningsfactor.
Groeifasen op een rij: Lag (aanpassing, OD nauwelijks stijgend) → Exponentieel (log-fase, OD verdubbelt per generatietijd) → Stationair (plateau) → Afsterving (OD daalt)
Kolonies omrekenen naar KVE/ml? Gebruik de kiemgetal-calculator (ISO 4833). Voor de meting zelf: spectrofotometers & cuvetten en petrischalen voor CFU-plaattellingen.
OD600 staat voor optische dichtheid gemeten bij een golflengte van 600 nm. Bij deze golflengte absorberen de meeste kweekbodems en celcomponenten minimaal licht, terwijl de cellen zelf de lichtbundel voldoende verstrooien om een betrouwbare meting mogelijk te maken. De keuze voor 600 nm is daarmee een pragmatisch compromis: de achtergrondabsorptie van het groeimedium is laag, de meting is niet-destructief en het benodigde apparatuur (een standaard spectrofotometer of fotometer) is in vrijwel elk laboratorium beschikbaar.
De meting berust op het principe van de wet van Beer-Lambert: de absorptie van licht is evenredig met de concentratie van de lichtabsorberende of lichtverstrooiende deeltjes en de padlengte van de cuvet. In de praktijk geldt dit lineaire verband voor bacteriële suspensies ruwweg tussen OD600-waarden van 0,1 en 0,8. Buiten dit bereik wijkt de meting significant af van lineariteit en moet worden verdund.
Wanneer bacteriën worden geïnoculeerd in vers groeimedium, doorlopen ze een karakteristiek groeipatroon dat bestaat uit vier opeenvolgende fasen. Het volgen van de OD600 in de tijd geeft direct inzicht in welke fase de cultuur zich bevindt, wat essentieel is voor het plannen van experimenten, het bepalen van het optimale oogsttijdstip en het begrijpen van de fysiologie van de cellen.
Direct na inoculatie passen de cellen zich aan aan het nieuwe milieu. Er vindt nauwelijks celdeling plaats, maar de cellen zijn metabolisch actief: ze synthetiseren enzymen, bouwen ribosomen op en repareren eventuele schade opgelopen tijdens opslag of overdracht. De OD600 stijgt in deze fase nauwelijks. De duur van de lag-fase is afhankelijk van de fysiologische toestand van het inoculum, de temperatuur en de samenstelling van het medium.
In de exponentiële fase is de groeisnelheid maximaal en constant. Elke generatietijd verdubbelt het aantal cellen, wat resulteert in een rechte lijn wanneer de log van de OD600 wordt uitgezet tegen de tijd. Voor Escherichia coli bij 37 °C in rijke media bedraagt de generatietijd typisch 20–30 minuten; voor Saccharomyces cerevisiae bij 30 °C circa 90 minuten. Cellen in de log-fase zijn uniform van grootte en fysiologische toestand, en daarmee het meest geschikt voor biochemische experimenten, eiwit-expressie en het bepalen van de minimale inhibitoire concentratie (MIC) van antibiotica.
Wanneer voedingsstoffen uitgeput raken of toxische metabolieten zich ophopen, komt de netto groei tot stilstand: de celdelingsnelheid en de afstervingssnelheid zijn in evenwicht. De OD600 bereikt een plateau. In de stationaire fase activeren veel micro-organismen stress-respons-mechanismen en produceren ze secundaire metabolieten. Voor fermentatietoepassingen is de stationaire fase soms juist het gewenste oogstmoment, afhankelijk van het doelproduct.
In de afsterfase overtreft de sterfte de celdeling. Cellen lyseren, waardoor de OD600 daalt. Celinhoud komt vrij in het medium, wat de OD-meting kan verstoren: dode cellen en celresten verstrooien licht maar zijn niet levensvatbaar. Dit is een belangrijke reden waarom OD600 alleen levende celconcentratie meet in de log- en vroege stationaire fase.
Voorafgaand aan elke meting wordt het spectrofotometer genulld (geblankeerd) met steriel groeimedium of buffer zonder cellen. Dit compenseert voor de achtergrondabsorptie van het medium zelf. Het blank-monster moet identiek zijn aan het groeimedium van de kweek, inclusief eventuele supplementen. Bij gebruik van complexe media zoals LB-bouillon is consistentie in blankvoorbereiding cruciaal voor vergelijkbaarheid tussen metingen.
Neem een representatief monster van de kweek onder aseptische omstandigheden. Bij OD600-waarden boven 0,8 dient het monster te worden verdund met steriel groeimedium of fysiologisch zout tot een OD600 binnen het lineaire meetbereik van 0,1–0,8. Verdun bij voorkeur serieel (1:2, 1:5 of 1:10) en reken de gemeten OD terug met de verdunningsfactor. Gebruik altijd hetzelfde verdunningsmiddel als het blank.
Vul een schone cuvet met het monster. Voor standaard spectrofotometers wordt een cuvet met 1 cm padlengte gebruikt. Vermijd luchtbellen door de cuvet rustig te vullen en licht te tikken. Plaats de cuvet in de juiste oriëntatie in het apparaat (optische vlakken loodrecht op de lichtbundel) en lees de OD600-waarde af. Noteer datum, tijdstip, verdunningsfactor en de ruwe meting voor de labjournaaldocumentatie.
De werkelijke OD600 van de onverdunde kweek = gemeten OD × verdunningsfactor. Voor kwantitatieve celtellingen kan de OD worden omgezet naar cel/ml via een vooraf opgestelde kalibratiecurve. Deze curve wordt eenmalig opgesteld door parallelle OD-metingen en plaattellingen (CFU/ml) of Coulter counter-metingen uit te voeren over het volledige groeibereik.
Voor een complete en reproduceerbare celgroei-analyse zijn de volgende materialen en apparatuur nodig.
Een standaard UV/Vis-spectrofotometer instelbaar op 600 nm is de meest universele oplossing. Dedicated celgroei-fotometers (zoals de Biochrom Novaspec of vergelijkbare instrumenten) zijn gefixeerd op 600 nm en eenvoudiger in gebruik. Voor hoge-doorvoer toepassingen zijn microplaat-readers met 600 nm-filter een efficiënt alternatief voor 96- of 384-wells groei-monitoring.
Voor OD600-metingen zijn wegwerpcuvetten van PMMA of polystyreen voldoende — bij 600 nm zijn beide materialen transparant. Kwartscuvetten zijn niet nodig tenzij ook UV-metingen worden uitgevoerd. Gebruik altijd een cuvet met 1 cm padlengte voor consistentie met literatuurwaarden. Beschikbaar in ons assortiment: optisch onderzoek & microscopie.
Voor parallelle plaattellingen (CFU-bepaling) zijn steriele petrischalen van 90 mm onmisbaar. Uitplaatverdelers en inoculatielusjes zorgen voor een reproduceerbare verdeling van het monster over het agaroppervlak. Bekijk ons assortiment petrischalen, PCR-platen & microtiterplaten.
Voor het pelleteren van cellen (ter bepaling van celdrooggewicht of voor wassen voor OD-meting) zijn centrifugebuizen en reactievaatjes van 1,5 ml, 15 ml en 50 ml nodig. Gebruik buizen van polypropyleen die compatibel zijn met de gebruikte centrifuge en rotor.
Nauwkeurig pipetteren is essentieel voor betrouwbare verdunningsreeksen. Gebruik gekalibreerde micropipetten voor volumes van 2–1000 µl en filterpipetpunten voor aseptisch werk om kruisbesmetting te vermijden. Ons assortiment pipetten en pipetpunten & tips biedt oplossingen voor elk volume.
Bij het werken met grotere cellen of celclusters — zoals plantencelculturen, schimmeldraden of aggregerende gistcellen — is een celzeef nodig om aggregaten te verwijderen vóór de OD-meting. Celclusters verstrooien licht disproportioneel en geven een overschatting van de celconcentratie. Een stamper wordt gebruikt in combinatie met de celzeef bij het bereiden van eencellige suspensies uit weefsel of vaste kweek. Bekijk onze celzeef in ons assortiment.
Een tafelcentrifuge is nodig voor het pelleteren van cellen bij celdrooggewicht-bepaling, het wassen van cellen voor OD-metingen in alternatief medium, en het bereiden van celvrij supernatant voor substraatanalyse. Bekijk ons assortiment laboratorium centrifuges.
OD600 is een indirecte, geïntegreerde maat voor celmassa — de methode meet verstrooiing van licht door alle deeltjes in de suspensie, niet uitsluitend levende cellen. Dit heeft een aantal praktische consequenties die de analist moet kennen.
OD600 is niet in alle situaties de meest geschikte methode. Afhankelijk van het organisme, de nauwkeurigheidseis en de beschikbare apparatuur zijn alternatieve of complementaire methoden beter geschikt.
Plaattelling is de goudstandaard voor het bepalen van het aantal levensvatbare cellen. Een bekende verdunningsreeks wordt uitgeplate op selectief of niet-selectief agar en het aantal kolonies wordt geteld na incubatie. CFU/ml meet uitsluitend levende, deelbare cellen — een fundamenteel verschil met OD. Nadeel: resultaten zijn pas na 12–48 uur beschikbaar (afhankelijk van het organisme) en de methode is arbeidsintensief.
Met een hemocytometer en een lichtmicroscoop worden cellen direct geteld in een bekende volumina. De methode is snel en geeft directe celconcentratie in cellen/ml. Door combinatie met vitaliteitskleuring (trypan blauw, propidiumjodide) kan onderscheid worden gemaakt tussen levende en dode cellen. Geschikt voor eukaryote cellen (gist, zoogdiercellen); voor bacteriën is de resolutie van een standaard lichtmicroscoop onvoldoende.
Cellen worden gecollecteerd door centrifugatie, gewassen en gedroogd bij 105 °C tot constant gewicht. CDG is de meest directe maat voor celmassa en wordt gebruikt als referentie voor kalibratie van OD-metingen en voor massabalansberekeningen in fermentatieprocessen. Nadeel: destructieve en tijdrovende methode, niet geschikt voor frequente monitoring.
Flowcytometrie biedt naast celtellingen ook informatie over celgrootte, granulositeit en de aanwezigheid van specifieke markers (fluorescente antilichamen, DNA-kleuringen). De methode is bijzonder waardevol voor heterogene celpopulaties en voor het bepalen van celcyclusdistributie. Lees meer in ons artikel over flowcytometrie.
Een Coulter counter meet de elektrische impedantieverandering wanneer een cel door een nauwe opening stroomt. Dit geeft nauwkeurige celtellingen en celgroottedistributies onafhankelijk van optische eigenschappen. Breed ingezet in de farmaceutische industrie en voor bloedceltelling.
De MTT-assay is een colorimetrische methode voor het meten van celviabiliteit en celproliferatie, met name bij zoogdiercellen en tumorcelllijnen. Metabolisch actieve cellen reduceren het gele MTT-reagens (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide) tot een paars formazanproduct. De hoeveelheid formazaan, gemeten als absorptie bij 570 nm, is evenredig met het aantal levende, metabolisch actieve cellen. De MTT-assay is daarmee gevoelig voor zowel celproliferatie als cytotoxiciteit — een belangrijk verschil met OD600, dat geen onderscheid maakt tussen levende en dode cellen. Verwante assays zijn de MTS-, WST-1- en resazurine (PrestoBlue)-assay, die een vergelijkbaar principe gebruiken maar direct oplosbare kleurproducten vormen en daardoor minder bewerkingsstappen vereisen. Voor kwantitatieve celtellingen in combinatie met viabiliteitsbepaling kan ook flowcytometrie worden ingezet.
In onderzoek naar celproliferatie worden specifieke moleculaire markers gebruikt die aantonen dat een cel actief deelt. De meest toegepaste zijn Ki-67, een nucleair eiwit dat tot expressie komt in alle actieve fasen van de celcyclus (G1, S, G2 en M) maar afwezig is in rustende cellen (G0), en BrdU (bromodeoxyuridine) of het veiliger alternatief EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine), die worden ingebouwd in nieuw gesynthetiseerd DNA tijdens de S-fase. Detectie van deze markers vindt plaats via immunofluorescentie of flowcytometrie. Ze geven kwantitatieve informatie over het percentage delende cellen in een populatie — iets wat OD600 of CFU niet kunnen bieden. Voor celcyclus-analyse en het opstellen van een proliferatietest zijn deze markers onmisbaar in moleculair-biologisch en farmacologisch onderzoek.
Via kwantitatieve PCR op specifieke celmarkers (zoals 16S rRNA-gen voor bacteriën) kan de hoeveelheid genetisch materiaal worden gekwantificeerd als maat voor celdichtheid. Bijzonder waardevol voor complexe mengpopulaties of omgevingsmonsters waar cultivering niet mogelijk is. Lees meer in ons artikel over SNP-genotypering en PCR-technieken.
De keuze voor 600 nm is gangbaar voor bacteriën en gist, maar niet universeel. Voor bepaalde toepassingen worden andere golflengten gebruikt.
Een kalibratiecurve maakt het mogelijk om OD600-waarden te converteren naar absolute celconcentraties (cellen/ml of CFU/ml). De curve is organisme-, medium- en instrumentspecifiek en moet eenmalig worden bepaald voor elke nieuwe combinatie. De procedure is als volgt:
Voor E. coli geldt als ruwe vuistregel dat OD600 = 1,0 overeenkomt met circa 8 × 108 cellen/ml, maar dit varieert sterk per stam, groeimedium en spectrofotometer.
Voor de omrekening van kolonietellingen naar KVE/ml kunt u gebruik maken van onze kiemgetal calculator, conform ISO 4833.
Voor vragen over de juiste materiaalkeuze voor uw specifieke toepassing — of het nu gaat om bacteriële fermentatie, celkweek of algenteelt — kunt u contact opnemen met ons voor deskundig advies. Neem contact op of bekijk ons volledige assortiment voor biotechnologie & moleculaire biologie.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
