Proteomics is de grootschalige studie van eiwitten — de complete set eiwitten die een cel, weefsel of organisme op een bepaald moment tot expressie brengt, het zogenoemde proteoom. Waar genomics de blauwdruk van het leven in kaart brengt, beschrijft proteomics de werkelijke functionele uitvoering ervan: welke eiwitten worden gemaakt, in welke hoeveelheden, in welke gemodificeerde vormen, en hoe verandert dat patroon bij ziekte, ouderdom, stress of behandeling. Twee-dimensionale polyacrylamide-gelelektroforese (2D-PAGE of 2-DE) is de klassieke scheidingsmethode binnen de proteomics: in één gel worden honderden tot duizenden eiwitten gescheiden op twee orthogonale eigenschappen — isoëlektrisch punt en moleculair gewicht — wat een uniek "vingerafdruk-patroon" van het proteoom oplevert. In dit artikel leest u wat proteomics is, wat de relatie tot proteoom, genoom en metabolomics is, hoe 2D-PAGE werkt, wat het verschil tussen 1D- en 2D-elektroforese is, welke kleuringen en detectiemethoden er bestaan, hoe de koppeling met massaspectrometrie verloopt, en welke moderne ontwikkelingen (DIGE, gel-vrije proteomics, top-down) er zijn.
Proteomics is het onderzoeksveld dat zich richt op de identificatie, kwantificering en functionele karakterisering van alle eiwitten in een biologisch systeem. De term werd in 1995 geïntroduceerd door Marc Wilkins als analoog van "genomics", en is sindsdien uitgegroeid tot een centraal onderdeel van de moleculaire levenswetenschappen. Het proteoom is fundamenteel complexer dan het genoom: een mens heeft circa 20.000 eiwitcoderende genen, maar door alternatieve splicing en post-translationele modificaties (fosforylering, glycosylering, ubiquitinering en vele andere) ontstaan er miljoenen verschillende eiwitvormen, proteoforms genoemd.
Proteomics omvat meerdere subdisciplines:
De twee technologische pijlers van moderne proteomics zijn scheidingstechnieken — waarvan 2D-PAGE de oudste en visueel meest informatieve is — en massaspectrometrie voor identificatie en kwantificering.
De term proteomics is een samenstelling van proteoom en het achtervoegsel -omics. Proteoom zelf is in 1994 gemunt door Marc Wilkins tijdens zijn proefschrift in Sydney, als samentrekking van prote(ïne) en -oom, naar analogie van genoom. Het achtervoegsel -omics verwijst in de moderne levenswetenschappen naar het bestuderen van een complete biologische verzameling tegelijk. Zo bestudeert genomics het volledige DNA, transcriptomics alle mRNA-moleculen, proteomics alle eiwitten en metabolomics alle kleine moleculen (metabolieten). De term proteomica komt soms voor in oudere of vertaalde teksten en betekent hetzelfde als proteomics; de Engelse vorm is internationaal de standaard.
Eiwitten — ook proteïnen genoemd — zijn de moleculaire werkpaarden van de cel. Ze worden gevormd door ribosomen volgens de instructies in het DNA, en vervullen vrijwel elke functie in het organisme: enzymen katalyseren chemische reacties, structuureiwitten geven cellen en weefsels hun vorm (collageen, keratine, actine), transporteiwitten verplaatsen stoffen door het lichaam (hemoglobine, albumine), receptoren ontvangen signalen aan het celoppervlak, antilichamen verdedigen tegen pathogenen, hormonen reguleren fysiologische processen, en motorische eiwitten (myosine, kinesine) zorgen voor beweging. Een typische menselijke cel bevat tienduizenden verschillende eiwitten in concentraties die over zeven tot tien ordes van grootte kunnen variëren — een complexiteit die proteomics technisch veeleisend maakt.
De begrippen proteoom en proteomics worden vaak door elkaar gebruikt, maar betekenen iets anders:
Een tweede begrip dat soms verwarring oplevert, is proteasoom. Dit is iets totaal anders: het proteasoom is een groot eiwitcomplex in de cel dat oude of beschadigde eiwitten afbreekt, een soort cellulaire "vuilverwerking". Proteasoom en proteoom klinken op elkaar, maar zijn niet aan elkaar verwant.
Het genoom en het proteoom beschrijven verschillende lagen van het biologische systeem:
De relatie tussen beide is niet 1:1. Eén gen codeert vaak voor meerdere eiwitvormen door alternatieve splicing, en eiwitten ondergaan na vertaling tientallen tot honderden modificaties. Schatting: 20.000 menselijke eiwitcoderende genen leveren minstens 1 miljoen verschillende eiwitvormen op. Dat maakt proteomics technologisch lastiger dan genomics, maar tegelijk informatiever over wat een cel of weefsel werkelijk doet. Voor de bestudering van het genoom zelf, zie het artikel over next-generation sequencing.
Proteomics maakt deel uit van een bredere familie systeembiologische onderzoeksvelden:
De integratie van meerdere omics-lagen in één studie heet multi-omics en levert een meer compleet beeld van een biologisch systeem dan elk afzonderlijk vakgebied.
2D-PAGE staat voor two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis en is een scheidingstechniek waarbij eiwitten in twee opeenvolgende stappen op twee verschillende eigenschappen worden gescheiden. De techniek werd in 1975 onafhankelijk gepubliceerd door Patrick H. O'Farrell en door Joachim Klose. O'Farrell wist op één gel meer dan duizend eiwitten van Escherichia coli als afzonderlijke vlekken (spots) zichtbaar te maken — een doorbraak die de basis legde voor de hedendaagse proteomics.
Het principe berust op de combinatie van twee orthogonale scheidingsmechanismen:
Doordat de twee criteria onderling onafhankelijk zijn, vormen eiwitten met dezelfde pI maar verschillend gewicht (of omgekeerd) afzonderlijke vlekken op de gel. Een typische 2D-gel toont 1000–2500 eiwit-spots in een patroon dat karakteristiek is voor het onderzochte monster.
Klassieke 1D-elektroforese — uitgevoerd als SDS-PAGE — scheidt eiwitten op één eigenschap: moleculair gewicht. Alle eiwitten met ongeveer hetzelfde gewicht eindigen op dezelfde hoogte in de gel, in één enkele baan. Voor een eenvoudig eiwitmengsel (bijvoorbeeld de fracties uit een eiwitzuivering) levert dit duidelijke banden op; voor een complex monster met duizenden eiwitten verzamelen die zich echter in een handvol brede, overlappende banden waarin individuele eiwitten niet meer te onderscheiden zijn. Voor algemene informatie over deze techniek zie het kennisbankartikel over gelelektroforese.
Bij 2D-elektroforese wordt aan deze enkele dimensie een tweede onafhankelijke dimensie toegevoegd — isoëlektrische focusing — die de eiwitten eerst spreidt op pI. Het resultaat is een tweedimensionaal patroon waarin elk eiwit als een afzonderlijke vlek (spot) verschijnt op coördinaten (pI, MW). Een typische 2D-gel maakt 1000–2500 spots zichtbaar; in 1D zouden diezelfde eiwitten in 20–40 banden samenvallen. 2D-PAGE biedt dus een twee- tot honderdvoudig hogere oplossingscapaciteit.
De prijs voor deze winst is complexiteit: 2D-PAGE duurt langer (twee tot vijf dagen), vereist meer technische vaardigheid en is gevoeliger voor experimentele variabiliteit. Voor toepassingen waarbij alleen de massa van interesse is — een eiwitzuiveringscontrole, een western blot, een snelle reinheidsbepaling — blijft 1D-SDS-PAGE de logische keuze. Voor proteoomschaal-analyses is 2D onmisbaar.
Bij isoëlektrische focusing wordt het eiwitmengsel aangebracht op een strip die een immobilized pH-gradient (IPG-strip) bevat — een polyacrylamide-strip waarin tijdens fabricage een gradient van zwakke zuren en basen is verankerd, doorgaans van pH 3 aan de anode-zijde tot pH 10 aan de kathode-zijde. Onder invloed van een aangelegde spanning migreren de eiwitten door de gradient. Een eiwit met netto positieve lading beweegt richting de kathode (basisch); een negatief geladen eiwit richting de anode (zuur). Op het punt waar de pH gelijk is aan het isoëlektrisch punt van het eiwit, draagt het eiwit netto geen lading en stopt de migratie. Op deze manier "focusseren" alle eiwitten met dezelfde pI in een scherpe band op één plek in de strip.
IPG-strips waren een grote verbetering ten opzichte van de oorspronkelijke IEF-methode met vrije ampholiet-buffers in glasbuisjes, omdat de gradient stabiel is gefixeerd in de gel-matrix. Hierdoor verdween de zogeheten cathodic drift en werd 2D-PAGE veel reproduceerbaarder. IPG-strips zijn commercieel verkrijgbaar in verschillende pH-bereiken:
IEF duurt typisch 6–24 uur en wordt vaak uitgedrukt in volt-uren — een maat voor de totale elektrische arbeid die in het systeem is gestopt. Voor een goede focusering zijn typisch 30.000–100.000 V·h nodig.
Na IEF wordt de IPG-strip eerst geëquilibreerd met SDS (natriumdodecylsulfaat) en een reductor (DTT of TCEP), waarna alkylering plaatsvindt met iodoacetamide. SDS is een anionisch detergens dat zich proportioneel aan de lengte van het eiwit aan het peptideskelet bindt. Het gevolg is dat alle eiwitten een uniforme negatieve lading-per-massa-verhouding krijgen, en hun oorspronkelijke pI verdwijnt; ze migreren in een elektrisch veld uitsluitend op basis van grootte. De equilibratiestap is cruciaal — eiwitten die niet goed met SDS zijn gecoat zullen onvolledig in de tweede dimensie scheiden. Tegelijkertijd zorgt deze stap voor enig eiwitverlies (5–25 %), wat een bekende bron van variabiliteit tussen gels is.
De geëquilibreerde IPG-strip wordt vervolgens op de bovenkant van een SDS-polyacrylamide-gel geplaatst en met een agarose-laag verzegeld. Onder invloed van een hoge spanning migreren de eiwitten loodrecht op de strip de gel in. Kleine eiwitten bewegen sneller door de polymeermatrix dan grote, met als resultaat dat na elektroforese alle eiwitten verspreid liggen in een 2D-patroon: horizontaal gerangschikt op pI (van zuur links naar basisch rechts), verticaal op moleculair gewicht (groot bovenaan, klein onderaan).
Het percentage acrylamide in de gel bepaalt het effectieve scheidingsbereik:
Na elektroforese zijn de eiwitten in de gel onzichtbaar en moeten ze met een kleuring of label zichtbaar worden gemaakt. De keuze hangt af van het benodigde detectielimiet, kosten, downstream-compatibiliteit met massaspectrometrie en de noodzaak tot kwantificering.
De gekleurde gel wordt gescand of gefotografeerd met een gespecialiseerd densitometrisch systeem, waarna beeldanalysesoftware (PDQuest, Progenesis, Delta2D, Melanie) de spots automatisch detecteert, kwantificeert en vergelijkt tussen gels.
Een belangrijke verbetering op klassieke 2D-PAGE is 2D-DIGE (Differential In-Gel Electrophoresis), in 1997 geïntroduceerd door Ünlü en collega's. Bij DIGE worden twee of drie monsters vooraf gelabeld met spectraal verschillende fluorescente cyanine-kleurstoffen (Cy2, Cy3, Cy5) en vervolgens in dezelfde gel gescheiden. Hierdoor verdwijnt de tussen-gel-variabiliteit volledig en kunnen verschillen tussen monsters met grote precisie worden bepaald. Vaak wordt een interne standaard (een mengsel van alle monsters gelabeld met Cy2) gebruikt om gels onderling te normaliseren.
Bij de analyse van DIGE-data zijn twee statistische aandachtspunten van belang. Ten eerste de normalisatie: ondanks het gebruik van een interne standaard kunnen kleine systematische verschillen tussen gels en kanalen blijven bestaan, die met software-routines (LOESS-normalisatie, variance-stabilizing normalization) gecorrigeerd worden. Ten tweede de missing values: niet elke spot is in elke gel detecteerbaar, vooral aan de detectielimiet. Standaardpraktijk is om imputatie toe te passen (bijvoorbeeld via k-nearest neighbors of MinDet) of om alleen spots te analyseren die in een minimum-percentage van de gels aanwezig zijn (typisch 70–80 %).
Bij proteomics van bloedplasma of -serum stuit men op een fundamenteel probleem: een handvol eiwitten domineert het monster en maskeert de interessantere laag-abundante eiwitten die vaak de gezochte biomarkers zijn. Humaan serum-albumine (HSA) alleen al vertegenwoordigt 50–60 % van het totale plasma-eiwit, en de top-7 eiwitten (albumine, IgG, transferrine, fibrinogeen, IgA, antitrypsine, haptoglobine) samen circa 85 %. Daaronder bevinden zich miljoenen mogelijke biomarkers met concentraties die over twaalf ordes van grootte uiteenlopen.
Voorafgaand aan 2D-PAGE wordt daarom een depletiestap uitgevoerd om deze dominante eiwitten te verwijderen:
Het nadeel van immunodepletie is dat ook laag-abundante eiwitten die aspecifiek aan dominante eiwitten zijn gebonden (de zogeheten "albuminome") gedeeltelijk verloren gaan — een belangrijke beperking om in publicaties expliciet te vermelden.
Een gel-spot alleen vertelt nog niet om welk eiwit het gaat. Voor de identificatie wordt de spot uit de gel "gepicket" (handmatig of met een geautomatiseerde spot-picker), in stukjes gesneden, ontkleurd en in-gel verteerd met een protease. De resulterende peptiden worden geëxtraheerd en met massaspectrometrie geïdentificeerd.
De keuze van protease bepaalt het peptide-profiel dat aan de massaspectrometer wordt aangeboden. Trypsine is verreweg de meest gebruikte: het splitst eiwitten specifiek aan de C-zijde van lysine (K) en arginine (R), met uitzondering van K-P en R-P bindingen. Trypsinepeptiden hebben een gunstig massabereik (800–3000 Da) en een C-terminaal basisch residu dat ionisatie bevordert. Voor specifieke vraagstukken bestaan alternatieven:
Voor algemene informatie over de techniek zelf, zie het kennisbankartikel over massaspectrometrie. Historisch werd voor het sequencen van eiwitten Edman-degradatie gebruikt, een chemische methode die N-terminale aminozuren één voor één afsplitst en identificeert. Hoewel Edman-degradatie nog steeds wordt toegepast voor N-terminale sequence-bevestiging, is massaspectrometrie sinds de jaren negentig de dominante methode geworden.
Voor kwantitatieve vergelijking tussen monsters bestaan verschillende strategieën:
Een typische 2D-PAGE-gebaseerde proteomics-studie verloopt in zes hoofdstappen:
De totale doorlooptijd bedraagt typisch drie tot vijf werkdagen voor een set van een handvol gels.
Een van de krachtigste toepassingen van 2D-PAGE is vergelijkende proteomics: hetzelfde proteoom analyseren onder twee of meer condities en de verschillen identificeren. Voorbeelden van zulke vergelijkingen zijn gezond versus ziek weefsel, behandeld versus onbehandeld, voor versus na een interventie, of verschillende ontwikkelingsstadia. De beeldanalysesoftware detecteert spots die in intensiteit verschillen (regulatie) of die in het ene monster wel en in het andere niet aanwezig zijn (presence/absence). Dergelijke "differentiële spots" zijn kandidaat-biomarkers en worden vervolgens via MS geïdentificeerd.
Statistisch significante verschillen worden bepaald met technieken als Student's t-test of ANOVA in combinatie met multipele-testcorrectie. Bij duizenden spots tegelijkertijd is een rauwe p-waarde < 0,05 onvoldoende — per definitie zou 5 % van de spots toevallig "significant" lijken. Standaardpraktijk is daarom controle van de false discovery rate (FDR) volgens Benjamini-Hochberg of Storey's q-waarde-methode, doorgaans op FDR < 5 % of < 1 %. Voor robuuste conclusies zijn gewoonlijk drie tot zes biologische replicaten per conditie nodig.
Een speciale variant van native PAGE is blue-native PAGE (BN-PAGE), ontwikkeld door Schägger en Von Jagow in 1991. In plaats van SDS wordt Coomassie Brilliant Blue G-250 gebruikt om eiwitten een negatieve lading te geven zonder ze te denatureren. Het gevolg is dat eiwit-eiwit-interacties in stand blijven en intacte multimere complexen op grootte kunnen worden gescheiden. BN-PAGE is bij uitstek geschikt voor:
BN-PAGE wordt vaak gecombineerd met een tweede SDS-PAGE-dimensie (2D BN/SDS-PAGE), waarbij eerst intacte complexen worden gescheiden en vervolgens hun samenstellende subunits.
2D-PAGE blijft, ondanks de opkomst van gel-vrije technieken, om een aantal redenen relevant:
De belangrijkste beperkingen zijn:
Sinds circa 2000 heeft gel-vrije proteomics — ook wel shotgun-proteomics genoemd — een grote opmars gemaakt. Hierbij wordt het eiwitmonster eerst volledig getrypsineerd, vervolgens worden de resulterende peptiden gescheiden met (vaak meerdimensionale) vloeistofchromatografie en direct gemeten met LC-MS/MS. Voor de scheidingstechnieken zelf, zie de kennisbankartikelen over HPLC, nano-LC en LC-MS en LC-MS/MS.
Gel-vrije methoden zijn doorgaans sneller, hebben een hogere doorvoer en kunnen meer eiwitten identificeren in één analyse. Ze leveren echter geen "kaart" van intacte eiwitvormen op en zijn minder geschikt voor het direct vergelijken van proteoforms. In moderne laboratoria worden gel-gebaseerde en gel-vrije methoden vaak complementair ingezet — DIGE-2D-PAGE voor visuele proteoform-analyse, LC-MS/MS voor diepere coverage en kwantificering.
Andere recente ontwikkelingen zijn top-down proteomics, waarin intacte eiwitten direct worden gemeten zonder voorafgaande tryptische digestie, en data-independent acquisition (DIA, ook wel SWATH-MS) waarmee reproduceerbare kwantificering over honderden monsters mogelijk is.
Proteomics en 2D-PAGE zijn breed inzetbaar:
Voor verwante eiwit-detectietechnieken die naast of na 2D-PAGE worden ingezet, zie de artikelen over western blot en ELISA.
Voor reproduceerbare 2D-PAGE-resultaten zijn enkele praktische punten cruciaal. De monstervoorbereiding bepaalt voor een groot deel het eindresultaat: onvolledige eiwitoplossing leidt tot streaking, vervuiling met zouten verstoort de IEF, en proteolytische afbraak veroorzaakt artefactspots. Werk altijd op ijs met verse protease-remmers, gebruik ultrazuiver water voor alle buffers, en pas een effectieve cleanup-stap toe vóór de IEF. Voor poederreagentia zijn de zuiverheidsgraad en herkomst belangrijk — voor het juiste niveau van zuiverheid, zie zuiverheidsgraden van chemicaliën. Voor opslag en veilig werken met denatureringsmiddelen als ureum, thio-ureum, DTT en acrylamide raadpleegt u het veiligheidsinformatieblad (VIB) van de betreffende stof.
Acrylamide is in monomere vorm een neurotoxine en mogelijk carcinogeen — werk altijd met handschoenen en bij voorkeur met kant-en-klare gels of voorgegoten oplossingen. Voor het bijbehorende glaswerk en kunststof artikelen — gel-platen, micropipetten, scheidingsbuffers — kunt u terecht in onze categorieën glaswerk en porselein en laboratoriumplastics.
Proteomics raakt aan tal van andere laboratoriumtechnieken. Voor de hoofdtechniek voor eiwit-identificatie, zie massaspectrometrie. Voor de eendimensionale tegenhanger van 2D-PAGE, zie gelelektroforese. Voor de chromatografische voorbereiding van peptiden in gel-vrije workflows, zie HPLC, UHPLC, nano-LC en LC-MS en LC-MS/MS. Voor verwante analytische scheidingstechnieken zie capillaire elektroforese. Voor genomics-context, zie next-generation sequencing. Voor immunologische eiwitdetectie zie western blot en ELISA.
Neem contact op voor advies over reagentia, glaswerk en disposables die passen bij uw proteomics-toepassing.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
